步驟

材料

無菌

培養(yǎng)瓶（如果需要離心時）

生長培養(yǎng)基

吸量管，1ml，10ml

注射器和19號針頭（如果你使用玻璃凍存管）

非滅菌

保護性手套和面罩

37℃無菌水，10cm深，盛于清潔、用乙醇擦拭過的帶蓋的水桶中

鑷子

70%乙醇

棉簽

1%萘黑（酰胺黑）或0.4%臺盼藍

操作步驟

1.檢查凍存目錄，確定將要復(fù)蘇的凍存管的位置

2.收集所有材料，準備培養(yǎng)基，標記培養(yǎng)瓶

3.從凍存罐中取出凍存管，檢查標簽，確定是否是所需要的凍存管，若小管未浸沒在液氮中，將小管放入塑料除菌水桶內(nèi)37℃的燒杯中。盡可能避免水沒過官帽，因為會增加污染的機會。

安全提示

將凍存管從液氮中取出時，必須穿實驗衣，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中，則必須待面罩或護目鏡，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復(fù)蘇時將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復(fù)蘇，以控制-爆-炸。

4.當凍存管復(fù)蘇時，再次檢查標簽以確定為所需的細胞；隨后用70%乙醇徹-底擦洗凍存管，然后在超凈工作臺內(nèi)打開凍存管，

5.用1ml吸管將凍存管內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。

6.將培養(yǎng)基緩慢的加至細胞懸液中:以每2min 10ml的速率進行滴加。開始時逐滴加入，然后可加快，逐漸稀釋細胞和細胞保護劑。

對于需要通過離心去除細胞保護劑的細胞：

（a）按照步驟6，在離心管或常規(guī)容器內(nèi)緩慢稀釋細胞。

（b）100g離心2min。

（c）棄去含有細胞保護劑的上清培養(yǎng)液。

（d）以新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

（e）接種入培養(yǎng)瓶。

7.凍存管內(nèi)殘留物可用萘黑或臺盼藍染色，以測定細胞的存活率。

8.24h后檢查：

（a）對于貼壁單層細胞，依據(jù)預(yù)測密度（個細胞/cm2)的細胞照片，確認細胞是否貼壁，估計細胞存活率。

（b）對于懸浮生長的細胞，檢查外觀（清晰的細胞質(zhì)，缺乏細胞顆粒），稀釋至常規(guī)的接種濃度。若進行細胞技術(shù)，并估計細胞存活率后，接種濃度可能更精確，這種情況下， 可以將細胞稀釋至常規(guī)存活細胞接種濃度。

注意事項

1. 將凍存管從液氮中取出時，必須穿實驗衣，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中，則必須待面罩或護目鏡，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復(fù)蘇時將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復(fù)蘇，以控制-爆-炸。

2. 塑料凍存管在使用前要仔細檢查，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不嚴。

3. 用DMSO作為凍存保護劑時，用前應(yīng)先將凍存液在4℃預(yù)冷，解凍后應(yīng)馬 上洗去保護劑。

常見問題

1. 檢查細胞活率。用1ml培養(yǎng)液重懸細胞，臺盼藍染料排除法檢查細胞存活率。

2. DMSO有-劇-毒，使用時要特別注意。此外，在凍存前越晚加入細胞越好，解凍后要盡快除去，以避免對細胞的毒害。