原理

活體染色是利用某種對(duì)植物無(wú)害的染料溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色的技術(shù)。中性紅是常用的活體染料之一，它是一種弱堿性pH指示劑，變色范圍在pH6.4-8.0之間（由紅變黃）。

在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應(yīng)。因此，進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大量陽(yáng)離子而呈現(xiàn)櫻桃紅色，在這種情況下，原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色；死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固，胞液不能維持在液泡內(nèi)。因此，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象。相反，中性紅的陽(yáng)離子，卻與帶有一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合，而使原生質(zhì)與細(xì)胞核染色。

材料與儀器

步驟

2. 切下一片較幼嫩的洋蔥鱗片，用單面刀片在鱗片內(nèi)側(cè)割劃成0.5cm2左右的小塊，用尖頭鑷子將內(nèi)表皮小塊輕輕撕下，即可投入中性紅溶液染色（注意應(yīng)將表皮內(nèi)側(cè)向下）。若用小麥葉片為材料，可將葉片背面朝上平放在載玻片上，再將此載玻片放入盛有少量清水的培養(yǎng)皿內(nèi)，用左手將葉片按平，右手用刀片從一個(gè)方向輕輕刮去下表皮和葉肉部分，只留下透明的上表皮細(xì)胞。當(dāng)刮到只剩下少量葉肉細(xì)胞時(shí)要十分小心，用力太重容易損傷表皮細(xì)胞，甚至只剩下一層細(xì)胞壁，太輕又會(huì)留下過(guò)多的葉肉細(xì)胞，影響觀察。除小麥外其他禾本科植物也可用此法制備表皮細(xì)胞，將刮好的材料切成約0.5cm2小塊。

3. 將制好的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮或小麥葉片上表皮小塊投入0.03%的中性紅溶液中染色5~10min，取出1~2片，在蒸餾水中稍加沖洗，在載玻片上滴一滴蒸餾水，小心地將制片平展到載玻片上，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察，可看到細(xì)胞壁被染成紅色，而原生質(zhì)和液泡均不染色，這是因?yàn)檎麴s水偏酸，在弱酸性條件下細(xì)胞壁帶負(fù)電荷和染料陽(yáng)離子發(fā)生吸附的結(jié)果。

4. 將步驟3中的活體染色制片取出幾片放入pH略高于7.0的自來(lái)水中浸泡10~15min，再置于載玻片上鏡檢，將發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁脫色，而液泡卻被染成深紅色，這是因?yàn)樵谌芤簆H高于7.0的情況下，中性紅分子的解離作用很弱，主要以分子狀態(tài)存在，不易被細(xì)胞壁吸附，但較易透過(guò)質(zhì)膜和液泡膜進(jìn)入液泡，而植物的細(xì)胞液多呈酸性反應(yīng)，進(jìn)入液泡的中性紅于是發(fā)生解離，將液泡染成櫻桃紅色。此時(shí)細(xì)胞核和原生質(zhì)不染色。

為了確證中性紅染色部位，可將上述洋蔥內(nèi)表皮染片浸入1mol/L的硝酸鉀溶液中浸泡10min左右，然后取出觀察。由于硝酸鉀能使原生質(zhì)強(qiáng)烈膨脹，發(fā)生“帽狀質(zhì)壁分離"，因而能清楚地區(qū)別開(kāi)無(wú)色透明的原生質(zhì)和染成紅色的液泡。

5. 將步驟4中的活體制片放在酒精燈火焰上微微加熱，以殺死細(xì)胞，再在顯微鏡下觀察，會(huì)看到原生質(zhì)凝結(jié)成不均勻的凝膠狀，與細(xì)胞核一起被染成紅色。

6. 在活體染色制片中仔細(xì)尋找，可能看到個(gè)別死細(xì)胞，其細(xì)胞核因被中性紅染色而呈紅色，清晰可辨。

注意事項(xiàng)